活細胞間接**熒光法

一．實驗器材：

1．  器材：

40孔塑料板、40孔板離心機、微量加樣器、振蕩器、蓋玻片、熒光顯微鏡等

2．  試劑：

活細胞間接**熒光法單抗隆抗體（單抗）、熒光標記抗鼠**球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、疊氮鈉（NaN3）等

二．方法（微量法）

1．  將分離好的單個核細胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分鐘。用含0.1% NaN3 PBS調細胞濃度在0.5-1×108/ml（5000萬-1億/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105細胞，活細胞間接**熒光法然后加入單抗（**抗體）50ul（同時加入AB型血清5ul）振蕩混勻，置4℃，至少30分鐘。

2．  用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm離心3-5分鐘棄上清。

3．  加熒光標記抗鼠抗體（**抗體）工作液20ul，混勻振蕩置4℃/30分鐘（時間不能超過）。

4．活細胞間接**熒光法  用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，棄上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依據所加細胞量而定）振蕩均勻，點片，并加蓋玻片。

如想次日看結果可在第三步后每孔加入1%多聚甲醛PBS每孔

50ul，混勻置4℃過夜，次日離心棄上清按四步做法觀察結果（為膜熒光）。

活細胞間接**熒光法