磷酸鈣法轉染HEK293T細胞實驗方法

一.試劑配制

無菌水ddw： 高溫**; 分裝;

2XHBS： 280mM NaCl

10mM KCl

1.5 mM Na2HPO4

12 mM glucose

50 mM HEPES

Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 過濾**，分裝;

2M CaCl2： 過濾**，分裝。

二. 實驗過程：

1. 鋪細胞： 選擇狀態良好的293t細胞傳代， 2-3x105個細胞/35mm dish。

2. 20-24h后，待細胞長至鋪滿瓶底約50-70%的時候，進行轉染。下面就35mm dish為例，采用以下轉染體系：

ddw： 105ul

plasmid： 2 ug (如0.5ug/ul， 即用4ul)

2M CaCl2： 16.5ul

2XHBS： 125ul

按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。

先將前三者混勻， *后加2XHBS。

一種方法是，加2XHBS時要逐滴加入， 吹打至微現乳白色， 立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。

另一種方法是， 加入2XHBS后立即吹打約40下(不過這個要根據每個人的力道和吹打的頻率而定， 建議做一個梯度實驗，吹打不同的次數看哪次的轉染效率高以后就按這個次數來吹打)， 之后步驟同上， 立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。