改進的間接酶聯**法檢測磺胺類**
實驗原理
62.5mgTS，34.5mgN-羥基琥珀酰亞胺酯和45.3mg 1,3-二環己基碳二亞胺在1.5ml的干燥的N,N-二甲基酰胺中反應18h， 4oC，通過濾過作用移除生成的二環乙基脲沉淀物，得到濾液。濾液被加到含有65mgLPH 2ml的PBS中，用NaOH調節PH到7.6。這個混合液在4oC，攪拌24h。通過TLC檢測磺胺藥有沒有聚合現象。因為低堿性自由的氨基磺酸簇（例如，磺胺噻唑pka是2.36），尤其賴氨酸的氨基簇(pka10.28)。可能是每一種氨基酸形成酰胺的主要原因。24h后，這個反應混合物被轉移到透析液里，透析對抗1L 8M尿素12h，透析液被移到4L，50mM的碳酸氫氨中，接著移到4L，25mM的碳酸氫氨，每一種透析液至少8h。透析袋中的內容物被凍干。TS-bsa使用相同的方法，bsa代替LPH。
實驗試劑
無水硫酸鈉；150ml甲醇；100ml鹽酸； 2.1g 2-氨基-4-噻唑乙酸；
2.65g N-Acetylsulfanilyl chloride (ASC)；50ml吡啶；100ml二氯甲烷層；
5g硅膠；50g二氧化硅柱(50*2.4)；200ml 1:4的甲醇-氯仿洗脫
50ml 2MNAOH溶液；100ml 6N的鹽酸。
實驗材料
50 ml的圓底燒瓶
250 ml三頸燒瓶
實驗步驟
2-氨基-4-噻唑-乙酸甲酯的合成：
1. 在冰浴中，將無水硫酸鈉干燥的甲醇100ml，加到一個250ml的三頸燒瓶。
2. 將鹽酸氣體加到裝有甲醇的燒瓶中，不停攪拌，產生大量氣泡。當溶液的質量增加大約60g，停止加鹽酸。
3. 將2.1g的2-氨基-4-噻唑乙酸緩慢的加到燒瓶里，除去冰浴，攪拌10分鐘。
4. 燒瓶中的溶液進行回流6小時，此時為輕微的黃色溶液。
5. 將溶液移入一個快速蒸發儀中，加入25ml干燥的甲醇，移除溶劑。
6. 從乙酸乙酯和甲醇中再結晶出來的固體為合成的固體(熔點為169-171o C)，即2-氨基--噻唑乙酸甲酯，淺黃色。
N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羥基)甲基]-2-噻唑}-磺胺的合成：
1. 將2.65gN-Acetylsulfanilyl chloride(ASC)加到一個50ml的圓底燒瓶中，在攪拌下，加入5ml干燥的吡啶。
2. 將1.50g的2-氨基-4-噻唑乙酸乙酯緩慢的加入到吡啶溶液中，維持溫度在不超過40 oC。溶液為褐色的，進行回流，1.5h，冷卻到室溫。
3. 緩慢攪拌下，加入30ml溫水，用二氯甲烷(3*25)萃取。
4. 二氯甲烷層用硫酸鈉干燥，濾過，同時大部分溶劑用快速旋轉蒸發儀移除。加入大約5g硅膠，移除剩余的溶劑，留下一些淡黃色的粉末。這些粉末經過一個50g的二氧化硅柱(50*2.4)，這個柱子用150ml 1:4的甲醇-氯仿洗脫，.移除這些溶劑，得到N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羥基)甲基]-2-噻唑}-磺胺(1.6g，50%產量)。
N-[ 4- Carboxymethy1) -2-thiazolyl]sulfanilamide(TS)的合成：
25ml，2MNAOH溶液加到提純的0.95g N4-乙酰基-N1-{4-[(甲氧羥基)甲基]-2-噻唑}-磺胺中，回流2h，冷卻至室溫后，用6N的鹽酸調節PH到4.0。得到的渾濁的溶液用乙酸乙結合物測定抗原決定簇密度和自由芳香族氨基的存在。
1. 抗體準備
1) 四只10周齡雌性兔子，一只兔子被注射0.8ml無菌的PBS和FCA(1:1)的油狀混合物；兩只兔子被注射TS-結合LPH的混合液；另外一只兔子用ts-bsa做**原。老鼠被注射0.5mg的混合液(2*0.2ml)肩胛骨，0.8ml油狀混合物臀肌部(2*0.4ml)。兔子接受同樣的載體注射，不同的是FIA代替FCA，在**次注射后間隔2到4周。
2) 在4周后，從兔子耳源大靜脈取血，大約每只老鼠15毫升，6周時，通過心臟采血每只兔子大約70毫升，收集的血液室溫放置1.5小時，離心血清，1000轉，5分鐘，出現清亮的黃色的血清和紅色的血細胞沉積，血清被收集到1.5ml的密封的容器，保存到-20oC。
2. 從兔子血清中分離IgG
0.6ml蛋白A填充物被裝到10ml的一次性聚丙烯柱中，這個柱子用含0.02%疊蛋化鈉的10mlPBS沖洗。已經被濾過的血清0.5ml慢慢從蛋白A柱子的上端緩緩加入，大約停留15分。需15ml含疊氮化合物的PBS去洗脫除IgG的血清蛋白類，大約3分鐘。1ml血清蛋白類被收集。接下來，用大約5ml乙酸洗脫IgG。洗脫液被轉移到透析袋中 (4L，25mM的碳酸氫銨24h，每4h換液)。這個透析袋中的物質被冷凍干燥，儲存在-20oC。從0.5ml兔子血清可重獲 IgG約為2mg。
3. **球蛋白Fab片段的產生
1) 固定用的木瓜蛋白酶0.5ml被加到一個玻璃檢測管中。消化緩沖液(2.76g磷酸二氫鈉、3.80g乙二胺四乙酸鹽粉防己堿鹽和 3.51 g半胱氨酸氫氧化物，1M的氫氧化鈉調節PH到7.0)被加到檢測管中，木瓜蛋白酶可以經緩沖液酶被分離，重復用消化緩沖液洗脫酶一次。固定用的木瓜酶被懸浮在0.5ml的消化液中。凍干的IgG(4mg)溶解在2ml新鮮的消化液中，加入到經木瓜酶預處理過的檢測管里。在37 oC搖動水浴中溫育酶-IgG混合物5h。5h后，1.5ml 10 mM三氨基甲烷鹽酸緩沖液ph7.5，被加到IgG酶消化液中，Fab片段被分離。
2) Fab片段，不水解的IgG和Fc片段被裝到蛋白A填充物的頂部，洗脫柱用10mlPBS，在速度為1 mL/3 min，第1mL被丟棄，接下來的3 mL被收集轉移到透析袋中。用4L，25mM的碳酸氫銨24h，每4h換液。這個透析袋中的物質被冷凍干燥，從0.5mL兔子血清中重獲1.1 mgFab(通過凝膠等電點聚焦電泳確認Fab是否被純化)。
4. 間接ELISA，96孔微量滴定
1) 加入200μL含的20μg/mL(TS-OV，NS-OV，CS-OV)的0.01%的硫柳汞PBS，，4oC包被過夜，在每個板上放一塊濕袋。**天，倒掉包被液，每個孔加入200μL含的1%BSA的硫柳汞的PBS，再放到相同的袋子里，室溫1h。倒掉包被液，洗3次板，加入100 μ含0-25μg/mL磺胺藥的硫柳汞的PBS。
2) 稀釋血清至0.05%BSA的板被保存在塑料袋中，室溫2h，用硫柳汞PBS洗三次。加入稀釋3000倍的山羊抗兔子抗體，加入硫柳汞PBS至每孔200μL/well，包括空白組也被保存在塑料袋中，室溫2h，用硫柳汞PBS洗三次。
3) 酶作用底物，0.4 mg/mL(o-phe- nylenediamine)和過氧化銨(1.0mg/mL)，0.1M檸檬酸鹽，PH4.75加到每個孔里，200μL/well，在反應30min后，室溫條件下，用酶標儀測定吸收率，450nm測定吸收值。
